Wgląd w kriokonserwację: Sztuka zamrażania życia

16 lipca 2022 Blog

Źródło: ThermoFisher.comW ciągu

ostatnich dwóch dekad różnorodność biologiczna naszej planety dramatycznie się zmniejszyła. Ta utrata różnorodności życia może mieć poważne konsekwencje, w tym załamanie funkcjonalne ekosystemu. Jako takie, stało się niezbędne, aby zachować zagrożone gatunki teraz, aby zapewnić ich przetrwanie dla przyszłych pokoleń. Konwencjonalne techniki okazały się niewystarczające, co spowodowało konieczność zastosowania kriokonserwacji. Proces ten polega na zachowaniu komórek, tkanek, narządów lub jakiegokolwiek materiału biologicznego przed spodziewanym uszkodzeniem poprzez przechowywanie ich w wyjątkowo niskich temperaturach (-80°C przy użyciu_CO2

lub -196°C przy użyciu ciekłego azotu).

Krioprezerwacja polega przede wszystkim na przekształceniu wody obecnej w komórkach z postaci płynnej w stan stały. Podczas gdy normalna temperatura zamarzania wody wynosi 0°C, woda wewnątrz komórki potrzebuje znacznie niższej temperatury, aby zamarznąć. Wynika to z obecności cząsteczek nieorganicznych i soli, co powoduje, że cykle metaboliczne i aktywność biologiczna w komórkach/tkankach zostają niemal zatrzymane po odłożeniu ich w niskiej temperaturze.

Dlaczego konieczna jest konserwacja linii komórkowych?

Obecnie krioprezerwacja ma szerokie zastosowanie w zamrażaniu linii komórkowych. Zanim przejdziemy do omówienia sposobu kriokonserwacji, przyjrzyjmy się najpierw, dlaczego w ogóle ją przeprowadzamy. Większość linii komórkowych rośnie szybko, a jeśli nie są regularnie podkarmiane, to przy braku wystarczającej ilości powietrza i pożywienia stają się zbyt stłoczone i umierają. Podobnie, hodowle komórkowe wymagają stałej kontroli ze względu na ich wysoką podatność na zanieczyszczenia mikrobiologiczne. Dlatego badacze hodują kilka skupisk i zachowują je na później, gdy będą im potrzebne.

Proces krioprezerwacji

Opracowanie sterylnej kultury tkankowej

Przy wyborze gatunków roślin do konserwacji należy wziąć pod uwagę ich unikalne cechy morfologiczne i fizjologiczne oraz to, jak mogą one wpłynąć na zdolność eksplantatów do wytrzymania kriokonserwacji. Do konserwacji można pobrać z rośliny dowolną tkankę, w tym bielmo, hodowane komórki roślinne, zalążnie, komórki merystematyczne, merystemy, zarodki, protoplasty, kalus lub nasiona. Zazwyczaj najbardziej preferowane są kultury komórek zawiesinowych, które znajdują się w późnej fazie lagowej lub fazie log.

Dodanie krioprotektantów i obróbka wstępna

Krioprotektanty to związki, które mogą zapobiec uszkodzeniom komórek spowodowanym przez zamrażanie lub rozmrażanie. Krioprotektanty obniżają temperaturę zamarzania i superchłodzenia wody. W ten sposób proces tworzenia się kryształów lodu zostaje opóźniony podczas krioprezerwacji. Preferowane jest stosowanie kombinacji krioprotektantów w celu zapewnienia większej żywotności krioprezerwacji bez szkody dla komórek/tkanek.

Najczęściej stosowanymi krioprotektantami są: sulfotlenek dimetylu (DMSO), glicerol, etylen, propylen, sacharoza, mannoza, glukoza, prolina i acetamid.

Zamrażanie

Wrażliwość komórek na niską temperaturę zależy na ogół od gatunku rośliny i jest zmienna. Do różnych rodzajów wykorzystywanych technik zamrażania należą:

1. Technika powolnego zamrażania: Tkanka lub pierwotny materiał roślinny jest dopuszczany do stopniowego zamrażania w umiarkowanym tempie chłodzenia 0,5-5°C/min od 0°C do - 100°C. W tym momencie przenosi się ją do ciekłego azotu. Technika powolnego zamrażania sprzyja powolnej progresji wody z wnętrza komórki na zewnątrz. Zapobiega to zamarzaniu wewnątrzkomórkowemu i przyspiesza tworzenie się pozakomórkowych kryształów lodu. W ten sposób komórki roślinne są częściowo wysuszone i mogą lepiej wytrzymać. Metoda ta jest efektywnie wykorzystywana do kriokonserwacji kultur zawiesinowych.
2. Metoda szybkiego zamrażania: W tej metodzie fiolka z materiałem roślinnym jest umieszczana w ciekłym azocie. Podczas tego procesu następuje spadek temperatury z - 300° do - 1000°C/min. Cykl zamrażania przebiega tak szybko, że wewnątrz komórek powstają bardzo małe kryształki lodu. Szybkie zamrażanie stosuje się do kriokonserwacji wierzchołków pędów i zarodków somatycznych.
3. Metoda stopniowego zamrażania: Metoda ta jest mieszanką metodologii powolnego i szybkiego zamrażania, posiadającą zalety obu, i przebiega w sposób stopniowy. Materiał roślinny jest najpierw schładzany do temperatury pośredniej i trzymany przez około 30 minut. Następnie jest szybko schładzany poprzez umieszczenie go w ciekłym azocie. Strategia ta została skutecznie zastosowana do kriokonserwacji wierzchołków pędów, pąków i kultur zawiesinowych.
4. Liofilizacja: Technika ta działa na zasadzie sublimacji, czyli przekształcania ciała stałego w gaz, obejmuje etap zamrażania i suszenia. Liofilizacja jest szeroko wykorzystywana do zachowania biomolekuł i cząstek wielkocząsteczkowych, a także do ochrony komórek i tkanek w stanie suchym.

Przechowywanie

Zamrożone kultury powinny być przechowywane w określonej temperaturze. Zamrożone komórki/tkanki są zwykle przechowywane w temperaturze od - 70 do - 196°C. W temperaturze poniżej - 130°C, wewnątrz komórek mogą pojawić się kryształki lodu, zmniejszając ich żywotność. Preferowane warunki przechowywania to -150°C w ciekłym azocie w fazie parowej lub - 196°C w fazie ciekłej. Niezbędne jest konsekwentne śledzenie żywotności zarodków w poszczególnych próbach. Niezbędna jest odpowiednia dokumentacja przechowywania zarodków.

Rozmrażanie

Rozmrażanie jest zazwyczaj wykonywane poprzez zanurzenie zamrożonych próbek w fiolkach w łaźni wodnej o temperaturze pomiędzy 37-45°C z energicznym wirowaniem. Dzięki temu procesowi, rozmrażanie zachodzi szybko w tempie, które chroni komórki przed szkodliwym wpływem rozwoju kryształów lodu. Gdy nastąpi rozmrożenie, a lód całkowicie się roztopi, fiolki przenosi się do łaźni wodnej (20-25°C). Uszkodzenie komórek następuje w przypadku zbyt długiego pozostawienia ich w łaźni wodnej (37-45°C).

Ponowna hodowla

Rozmrożony zarodek jest dokładnie myty w celu usunięcia wszelkich krioprotektantów. Materiał ten jest następnie hodowany ponownie w świeżym podłożu zgodnie ze standardowymi procedurami. W niektórych przypadkach bezpośrednia hodowla jest wykorzystywana bez mycia, ponieważ uważa się, że specyficzne substancje uwalniane przez komórki w czasie zamrażania poprawiają jakość kultur in vitro.

Pomiar żywotności

Pomiar żywotności i przeżywalności zamrożonego materiału może być wykonany w każdej fazie kriokonserwacji lub w następstwie rozmrożenia lub ponownej hodowli. Metody określające żywotność kriokonserwowanych komórek są takie same jak w przypadku hodowli komórkowych. Powszechnie stosowane metody obejmują procedury barwienia chlorkiem trifenylo-tetrazolowym (TTC), błękitem Evana i dioctanem fluoresceiny (FDA).

Regeneracja roślin

Ten etap jest ostatecznym celem kriokonserwacji germplazmy. Krioprezerwowane komórki/tkanki muszą być starannie pielęgnowane i rozwijane w celu prawidłowego wzrostu i regeneracji roślin. Wraz z odpowiednim środowiskiem, ekspansja pewnych substancji stymulujących wzrost jest niezbędna do skutecznej regeneracji roślin.

Źródło: Britannica.com

Zalety kriokonserwacji

• Minimalne zapotrzebowanie na miejsce i pracę
• Leczenie niepłodności
• Ochrona integralności genetycznej znaczących plam
• Ochrona zagrożonych gatunków germplasmy
• Ochrona linii komórkowych przed skażeniem genetycznym
• Zachowanie próbek biologicznych przez dłuższy czas
• Ochrona linii komórkowych przed skażeniem mikrobiologicznym
• Zapobieganie dryfowi genetycznemu poprzez kriokonserwację gamet, zarodków itp.

Kriokonserwacja poczyniła niezwykłe postępy - od marzenia w głowie naukowców do metody ochrony cennych linii komórkowych do celów leczniczych i badawczych. Jednak do osiągnięcia pozostało jeszcze wiele kamieni milowych w poszukiwaniu nowych środków zwiększających żywotność komórek odrodzonych po kriokonserwacji. Naukowcy pracują nad przewidywanym wykorzystaniem różnych krioprotektantów o zmniejszonej toksyczności dla komórek oraz nad nowymi strategiami mrożenia, które zagwarantują zwiększoną żywotność komórek.

LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokowydajnych, specjalistycznych etykieti dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w placówkach służby zdrowia.