Przyszłość histologii cyfrowej

Histologia to badanie tkanek na poziomie mikroskopowym, powszechnie stosowane przez patologów do diagnozowania chorób. Tradycyjnie badania te obejmują wycinanie cienkich próbek z tkanek pacjenta, barwienie ich i obrazowanie pod mikroskopem. Jednak najnowsze osiągnięcia mogą wyeliminować potrzebę barwienia chemicznego i umożliwić uzyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości z grubych wycinków tkanek za pomocą techniki ilościowego obrazowania fazowego 3D.

Rozwój patologii cyfrowej

W konwencjonalnych metodach histologicznych kontrast obrazu uzyskuje się za pomocą barwników, takich jak hematoksylina i eozyna (H&E). Podejście to pozwala na uzyskanie wysoce specyficznych wyników, ale wymaga również stosowania substancji chemicznych podczas przygotowywania próbek, co może wydłużać czas preparatyki i powodować artefakty, opóźniając diagnozę patologiczną. Tradycyjne techniki histopatologiczne wymagają również cienkich wycinków tkanek, zwykle o grubości poniżej 5 μm. W związku z tym rozwój mikroskopii bezetykietowej ma na celu dalsze skrócenie czasu przygotowania próbki, wyeliminowanie stosowania ostrych środków chemicznych i umożliwienie wizualizacji grubszych wycinków tkanek.

Aby sprostać tym wyzwaniom, zastosowano kilka metod mikroskopii bezetykietowej1. Nieliniowa mikroskopia optyczna wykorzystuje nieliniowe interakcje między światłem a materią do generowania obrazów. Jednak długi czas oczekiwania na zebranie słabych sygnałów nieliniowych utrudnia szybkie skanowanie obrazów i szybką identyfikację obszarów patologicznych. Optyczna koherentna tomografia okazała się obiecująca, ale obrazowanie cech subkomórkowych jest ograniczone ze względu na szum plamki i rozdzielczość przestrzenną. Innym kandydatem jest ilościowe obrazowanie fazowe, charakteryzujące się większą szybkością obrazowania, ale zapewniające jedynie dwuwymiarowe informacje o cienkich próbkach tkanek1.

Najlepszym jak dotąd kandydatem w dziedzinie histologii cyfrowej jest optyczna tomografia dyfrakcyjna (ODT), pozbawiona etykiet ilościowa technika obrazowania fazowego 3D, która może generować informacje o obrazie wolumetrycznym. ODT rekonstruuje trójwymiarowy współczynnik załamania światła (RI) próbki tkanki na podstawie obrazów pola rozproszonego uzyskanych przy różnych kątach oświetlenia. Ponieważ wartość RI zależy od cząsteczek wewnątrzkomórkowych, w tym białek i lipidów, ODT umożliwia bezetykietowe ilościowe mapowanie morfologiczne 3D próbek biologicznych i była szeroko wykorzystywana do lepszego zrozumienia fizjologii różnych żywych komórek1. Dotychczas ODT nie radziła sobie z obrazowaniem grubych preparatów tkankowych, jednak w najnowszej publikacji udało się przezwyciężyć to ograniczenie dzięki zastosowaniu cyfrowego ponownego ogniskowania i automatycznego zszywania. Układ eksperymentalny umożliwił mezoskopowe obrazowanie różnych tkanek patologicznych w skali milimetrowej z rozdzielczością submikrometrową1.

ODT przezwycięża ograniczenia tradycyjnej histologii

W przeciwieństwie do innych technik obrazowania histologicznego, w których do wytworzenia kontrastu wykorzystuje się środki znakujące i barwniki, dyfrakcja optyczna wykorzystuje współczynnik załamania światła próbki, wewnętrzny parametr optyczny, do wytworzenia kontrastu obrazowego1. ODT wykorzystuje zatem RI do tworzenia obrazu 3D poprzez połączenie wielu ilościowych obrazów fazowych 2D uzyskanych pod różnymi kątami oświetlenia. Holografia pozaosiowa jest stosowana do akwizycji światła rozproszonego przechodzącego przez próbkę, przy czym wiele pól rozproszonych jest uzyskiwanych pod różnymi kątami, a następnie łączonych w celu odtworzenia RI próbki. Ponadto, wartości RI mogą się różnić w zależności od rodzaju obrazowanych cząsteczek wewnątrzkomórkowych i ich liczby. Dzięki temu ODT może zapewnić szczegółowy, strukturalny i ilościowy wgląd w różne niebarwione próbki biologiczne, w tym żywe komórki.

Metoda ta sprawdza się w przypadku cienkich histologicznych wycinków tkanek, podobnie jak w przypadku metod tradycyjnych. Aby rozszerzyć zastosowanie optycznej tomografii dyfrakcyjnej na grube próbki tkanek, Hugonnet i wsp. zastosowali cyfrowe ogniskowanie i automatyczne zszywanie w celu uzyskania dokładnych informacji o obrazie wolumetrycznym1. Cyfrowe ogniskowanie jest techniką generowania obrazów o różnej głębokości, wykorzystującą fakt, że obraz jest integralną projekcją 2D pola świetlnego 4D. Zszywanie obrazów to proces łączenia wielu obrazów z nakładającymi się polami widzenia w celu uzyskania pojedynczego segmentowanego obrazu panoramicznego o wysokiej rozdzielczości. Ta nowa metoda mikroskopii umożliwia wizualizację struktur subkomórkowych i mezoskopowych przy użyciu wysokiej rozdzielczości w połączeniu z szerokim polem widzenia, nawet w przypadku niebarwionych, grubych próbek tkanek.

ODT umożliwiła badaczom wizualizację pojedynczych komórek, wielokomórkowej architektury tkankowej i różnych cech morfologicznych z dokładnością porównywalną z konwencjonalnym barwieniem H&E. Ponieważ jednak technika ta nie wymaga długotrwałych procedur barwienia i może być stosowana na grubszych wycinkach tkanek, zmniejszyła lub wyeliminowała potrzebę pracochłonnego, tradycyjnego przetwarzania tkanek i metod barwienia. Dzięki temu patolodzy mogli uwidocznić różne cechy morfologiczne w różnych tkankach, co pozwoliło na szybsze rozpoznawanie i diagnozowanie zmian prekursorowych i patologii, skracając całkowity czas do postawienia diagnozy.

Perspektywy na przyszłość

Bezetykietowa holografia wolumetryczna ma ogromny potencjał w zakresie szybkiej i wysokorozdzielczej histopatologii grubych wycinków tkankowych, omijając potrzebę czasochłonnego przetwarzania tkanek i protokołów barwienia chemicznego. Ponieważ technikę tę można stosować do różnych rodzajów próbek tkanek, może ona umożliwić patologom postawienie diagnozy nowotworu w czasie rzeczywistym podczas śródoperacyjnych konsultacji patologicznych. Ponadto patologia cyfrowa może usprawnić analizę wieloskalowych obrazów wolumetrycznych, która przy zastosowaniu metod konwencjonalnych jest bardzo czasochłonna.

Histologia holograficzna, w jej obecnym wydaniu, nadal ma ograniczenia. Technika ta może być stosowana jedynie do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów tkanek o grubości do ∼ 100 μm. Nawet najnowsze techniki cyfrowego ogniskowania nie są w stanie przezwyciężyć niskiej jakości tomografów uzyskanych z grubszych tkanek z powodu wielokrotnego rozpraszania światła. Konieczne są dalsze badania w celu optymalizacji protokołów przygotowania próbek, poprawy szybkości rekonstrukcji i zminimalizowania artefaktów wynikających z wielokrotnego rozpraszania światła. Postęp w dziedzinie sprzętu i oprogramowania może również przyczynić się do dalszej poprawy wydajności tej metody. Nowo powstające metody uczenia maszynowego do segmentacji oraz oprogramowanie sztucznej inteligencji mogą również pomóc w usprawnieniu procesu analizy i rekonstrukcji obrazu.

Ponadto konieczne są dalsze badania nad tym, jak informacje o RI są interpretowane pod względem histologicznym. Ponieważ jest to wciąż nowa dziedzina, dane mogą być potencjalnie różnie interpretowane przez różnych patologów. Ponieważ jednak tomografy RI generują inne dane niż te uzyskane za pomocą tradycyjnego barwienia H&E, można je wykorzystać jako wyniki uzupełniające podczas analizy. Zastosowanie obu metod może znacząco poprawić czas do postawienia diagnozy, skracając czas potrzebny na rozpoczęcie leczenia, co z kolei może poprawić wyniki leczenia pacjentów.

LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokowydajnych etykiet specjalistycznychoraz dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w instytucjach opieki zdrowotnej.

Referencje:

1. Hugonnet H, Kim YW, Lee M, et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Advanced Photonics. 2021;3(2):1-8.