Mikromacierze tkankowe: Nowe narzędzie dla laboratoriów patologicznych

Nowoczesne technologie pozwalają na identyfikację markerów DNA/RNA i białkowych, które mogą być przydatne w klasyfikacji chorób i opracowywaniu leków. Jednak konwencjonalna analiza tkanek ludzkich metodą "slajd po slajdzie" okazała się trudnym wąskim gardłem, utrudniającym walidację tych ważnych kandydatów na geny i białka. Mikromacierze tkankowe (TMA) to stosunkowo nowa innowacja w dziedzinie patologii, która może pomóc w rozwiązaniu tego problemu i potencjalnie przyspieszyć proces przenoszenia badań podstawowych z laboratorium na stół.

Co to jest mikromacierz tkankowa i jakiego sprzętu wymaga?

TMA została zaprojektowana jako wysokowydajna technika biologii molekularnej dla naukowców oceniających wiele produktów genowych związanych z chorobami w wielu próbkach tkanek. Umożliwia ona przeprowadzanie wielkoskalowych analiz wycinków tkanek przy użyciu różnych technik, takich jak immunohistochemia (IHC) i hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH), w znacznie krótszym czasie i po niższych kosztach.

Każda mikromacierz tkankowa zawiera wiele dużych plamek składających się z małych wycinków histologicznych z unikalnych tkanek lub guzów1. TMA składa się z bloczka parafinowego, na którym umieszcza się różne cylindryczne próbki rdzenia tkankowego pobrane z bloczków "dawców", które są umieszczane w określonych współrzędnych tablicy. Dzięki temu w jednym bloku parafinowym można połączyć do 1000 próbek tkanek do dalszej analizy. Blok biorcy można następnie przygotować do sekcjonowania, przy czym każda sekcja zawiera plasterek z każdej próbki rdzeniowej, co umożliwia analizę markerów w standardowych warunkach na pojedynczej szklanej stronie1. Pozwala to nie tylko na bardziej spójną analizę różnych próbek tkanek, ale także na maksymalne wykorzystanie ograniczonych lub trudnych do zastąpienia próbek tkanek.

Ta nowa technika wymaga jednak zastosowania urządzenia do mikromacierzy tkankowych w celu przygotowania bloku mikromacierzy. Jednym z takich instrumentów jest Galileo TMA CM4600, który jest używany do pobierania rdzenia tkankowego z bloków dawcy. To konkretne urządzenie skanuje kod kreskowy każdego bloku, aby zapewnić prawidłowe śledzenie i umieszczenie, a po pobraniu rdzenia jest on umieszczany w pustym bloku parafinowym - bloku biorcy. Średnica rdzenia i odstępy na biorcy mogą być regulowane za pomocą ustawień instrumentu zgodnie z dokładnymi specyfikacjami określonymi przez użytkownika. Dzięki temu liczba plamek na szkiełku może się różnić w zależności od projektu mikromacierzy, który można następnie zapisać w arkuszu kalkulacyjnym, np. w programie Microsoft Excel. Galileo CM4600 posiada również konfigurowalny stolik, który umożliwia stosowanie bloków o różnych rozmiarach, w tym bloków makro i mega tkankowych, a także mikropłytek 96-dołkowych, gdy konieczne jest przeprowadzenie analizy DNA/RNA. Po zakończeniu tworzenia mikromacierzy można użyć mikrotomu do wygenerowania przekrojów szkiełek o grubości 5 µm do dalszych analiz molekularnych i immunohistochemicznych.

Przygotowując bloczki do sekcjonowania, dobrze jest mieć już przygotowane szkiełka mikroskopowe. Obejmuje to wydrukowanie etykiet odpornych na działanie substancji chemicznych dla każdego szkiełka, które będzie używane. W przypadku preparatów, które będą poddawane typowym analizom histologicznym, zaleca się stosowanie etykiet na szkiełka, które są odporne na działanie różnych silnych rozpuszczalników i barwników histologicznych. Dzięki temu etykieta nie odklei się ani nie rozmaże podczas wielu etapów procedury i pozostanie czytelna i możliwa do zeskanowania, ponieważ nie nabierze koloru od stosowanych barwników. Jeśli preparaty będą używane do analiz immunohistochemicznych, zalecamy stosowanie trwalszych etykiet, takich jak nasze etykiety HistoLAM. Te etykiety na szkiełka są wyposażone w laminację, która chroni wydrukowane informacje przed długotrwałym zanurzeniem w ksylenie, a także wysoką temperaturą i kwaśnymi/zasadowymi buforami stosowanymi w procesie odzyskiwania antygenów. Etykiety odporne na ksylen są również kompatybilne ze zautomatyzowanymi procesorami slajdów i barwiarkami.

Korzyści i możliwe zastosowania mikromacierzy tkankowych

Mikromacierze tkankowe oferują wiele korzyści i zalet w porównaniu z tradycyjnymi analizami, wykonywanymi na każdej próbce tkanki osobno. Jedną z głównych zalet TMA jest to, że pozwalają na wykorzystanie znacznie mniejszej ilości materiału. W rzeczywistości pozwalają one także na zachowanie oryginalnego bloku w stanie nienaruszonym, z usunięciem jedynie kilku próbek rdzeniowych. Jest to szczególnie przydatne, gdy blok musi być zwrócony innemu użytkownikowi lub zachowany do późniejszej analizy. Dzięki tej technice z biopsji można uzyskać znacznie więcej wycinków niż dotychczas. Na ogół jedna próbka może być cięta od pięćdziesięciu do stu razy, ale dzięki uzyskaniu reprezentatywnych próbek rdzeniowych każda próbka może teraz dostarczyć materiału do tysięcy badań, zwiększając potencjalnie ograniczone zasoby nawet 10 000-krotnie1.

Zgrupowanie wielu próbek w jednym bloku parafinowym pozwala również na identyczną obróbkę każdej z nich. Większość technik stosowanych do dalszej analizy wygenerowanych szkiełek może wprowadzać zmienność pomiędzy poszczególnymi szkiełkami, co może zniekształcać wyniki, prowadząc do błędnych odczytów. Analizując jedną partię próbek na jednym szkiełku mikroskopowym, można wystandaryzować wiele zmiennych, takich jak temperatura, czas inkubacji, procedury płukania i stężenie odczynników. Zastosowanie pojedynczego bloku biorcy ma również tę dodatkową zaletę, że do wykonania testów potrzeba mniejszej liczby odczynników. Pozwoli to również na uwolnienie personelu laboratoryjnego, który może teraz jednocześnie analizować dużą liczbę próbek. W ten sposób mikromacierze tkankowe zmniejszą liczbę testów, które muszą być wykonywane w laboratorium, oszczędzając czas i pieniądze.

Technika ta ma wiele zastosowań w badaniach podstawowych, prognostycznych w onkologii oraz w odkrywaniu leków. Okazała się ona skutecznym narzędziem zapewniania jakości. Zdolność TMA do ujednolicania analiz ułatwia standaryzację różnych testów, dzięki czemu wyniki są bardziej powtarzalne w różnych laboratoriach. Może ona również pomóc w optymalizacji różnych odczynników diagnostycznych, takich jak przeciwciała, stosowanych w różnych testach i jest postrzegana jako ulepszenie w stosunku do obecnie stosowanych kontroli.

Jednak jednym z głównych zastosowań TMA jest szybkie przełożenie odkryć molekularnych na zastosowania kliniczne. TMAs pozwalają na szybką i wszechstronną analizę markerów chorobowych, zwłaszcza w chorobach nowotworowych. Technika ta została zastosowana w badaniach nad nowotworami, umożliwiając kliniczną walidację nowo zidentyfikowanych biomarkerów genowych. Co więcej, może ona również pomóc w testowaniu różnych potencjalnych celów terapeutycznych przy użyciu próbek guzów pochodzących od konkretnych pacjentów z nowotworami. Doprowadziło to do opracowania różnych typów macierzy nowotworowych, w tym macierzy guzów, macierzy progresji nowotworów i macierzy prognostycznych. Tumor arrays umożliwiają badanie wielu guzów w poszukiwaniu nowego markera. Z kolei tablice progresji mogą śledzić zmiany molekularne na różnych etapach wzrostu guza, a tablice prognostyczne pozwalają ocenić rokowanie lub wynik leczenia pacjenta.

Analiza i automatyzacja o dużej wydajności

Prawdziwą zaletą TMAs jest ich zdolność do automatyzacji procesu patologii. Umożliwiając jednoczesną analizę do 1000 próbek tkanek w jednym eksperymencie, laboratoria mogą wykonywać różne badania o dużej wydajności2. Umożliwia to prowadzenie analiz genowych i molekularnych na dużą skalę, idealnych do gromadzenia danych z zakresu epidemiologii molekularnej, które w innym przypadku byłyby dość trudne. Co więcej, na wycinkach uzyskanych za pomocą TMA można przeprowadzać praktycznie wszystkie rodzaje badań in situ, takie jak IHC i FISH. TMA, optymalnie dostosowane do projektów ekspresji na dużą skalę, mogą być nawet wykorzystywane do oceny ekspresji wszystkich ludzkich genów w jednym zestawie tkanek2.

Podjęto również próby zautomatyzowania procesu tworzenia mikromacierzy tkankowych. Dotyczy to zarówno zautomatyzowanych urządzeń do tworzenia mikromacierzy tkankowych, jak i półautomatycznych, które są w stanie przygotować macierze w jeszcze krótszym czasie niż w przypadku pracy ręcznej. Automatyzację stosuje się także w procesie obrazowania, np. szkiełka mikroskopowe można zamieniać na obrazy cyfrowe, które można przechowywać, wyszukiwać i udostępniać w chmurze. Algorytmy analityczne mogą być również stosowane do identyfikacji i oceny ilościowej różnych wzorów i cech barwienia, aby przyspieszyć odkrywanie nowych markerów predykcyjnych.

LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokowydajnych etykiet specjalistycznychoraz dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w instytucjach opieki zdrowotnej.

Referencje:

1. Nazar M.T. Jawhar. Tissue Microarray: Szybko rozwijające się narzędzie diagnostyczne i badawcze. Ann Saudi Med 2009; 29(2): 123-127.
2. Khawla Al Kuraya, MD, FCAP; Ronald Simon, PhD; Guido Sauter, M D. Tissue microarrays for high-throughput molecular pathology. Ann Saudi Med 24(3) May-June 2004.